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   油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)屬于細(xì)胞工程技術(shù)，是在單細(xì)胞水平上獲得單倍體的方法之一，是獲得優(yōu)良種質(zhì)資源和培育新品種的一條行之有效的途徑。為了讓大家能更直觀的了解該技術(shù)，我們以現(xiàn)有實驗為基礎(chǔ)，對該技術(shù)進(jìn)行做以介紹。

   一、油菜小孢子培養(yǎng)機(jī)理

   油菜小孢子是指花粉母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂形成的四分體從釋放出來到形成成熟花粉粒之前的雄配子體（單倍性細(xì)胞）。正常情況下，四分體形成四個單核小孢子，單核小孢子經(jīng)分裂形成二核小孢子，二核小孢子繼續(xù)發(fā)育，形成三核小孢子，最后發(fā)育為成熟花粉粒。在離體培養(yǎng)時，選擇的單核晚期小孢子不再分裂為二核（營養(yǎng)核和生殖核），而是分裂為兩個均等的子細(xì)胞，兩個子細(xì)胞繼續(xù)均等分裂成四個細(xì)胞，如此分裂，直到成為多細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞團(tuán)繼續(xù)分裂發(fā)育為形狀不同的胚狀體，胚狀體進(jìn)一步發(fā)育為再生植株或先發(fā)育成不定芽、愈傷組織，再發(fā)育成植株。

   二、油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)

   油菜小孢子培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)有以下五個方面：

   1.培養(yǎng)基的配制。培養(yǎng)基是培養(yǎng)的基礎(chǔ)，需要配制B5、NLN兩大類培養(yǎng)基。根據(jù)蔗糖濃度、添加劑的不同，每類可配制多種。要無雜、無菌、pH適宜。B5培養(yǎng)基經(jīng)過濾除雜后高溫高壓蒸汽滅菌，NLN培養(yǎng)基過濾除雜后需過濾除菌。

（過濾除雜）

（過濾除菌）

   2.花蕾采摘取樣、鏡檢挑選。在開花前一周至初花期采蕾較好，直接進(jìn)行鏡檢挑選培養(yǎng)，或低溫預(yù)處理2～3d后鏡檢挑選培養(yǎng)。選取小孢子多數(shù)處于單核晚期至雙核早期發(fā)育階段的花蕾作為培養(yǎng)材料。

（花蕾鏡檢）

   3.游離培養(yǎng)。游離培養(yǎng)流程包括：（1）花蕾消毒；（2）花蕾破碎過濾；（3）B5培養(yǎng)基游離小孢子；（4）NLN培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)小孢子；（5）32℃熱激暗培養(yǎng)。前四步在超凈工作臺和離心機(jī)上操作，第五步在人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)。

（小孢子游離培養(yǎng)）

   4.誘導(dǎo)成胚培養(yǎng)。經(jīng)過2～3d的熱激暗培養(yǎng)后，具有胚狀體發(fā)生潛力的小孢子細(xì)胞會先膨大至原細(xì)胞的2～4倍，然后分裂為二細(xì)胞、四細(xì)胞……，通過鏡檢觀察，對形成膨大細(xì)胞的培養(yǎng)物更換NLN培養(yǎng)基，進(jìn)行誘導(dǎo)成胚的培養(yǎng)。培養(yǎng)步驟有：（1）鏡檢觀察，挑選適宜培養(yǎng)物；（2）培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至離心管離心，獲得小孢子沉淀；（3）用NLN培養(yǎng)基懸浮沉淀；（4）懸浮液轉(zhuǎn)至培養(yǎng)皿，25℃暗培養(yǎng)。

（人工氣候箱內(nèi)暗培養(yǎng)）

   5.胚狀體再生成苗培養(yǎng)。誘導(dǎo)暗培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼可見胚狀體大約需要2～3周。胚狀體形成后，恒溫振蕩培養(yǎng)一周左右，可將心型、魚雷型、子葉型等形狀的胚狀體接種到B5固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至長成幼苗植株。獲得的再生植株，經(jīng)后續(xù)繼代、煉苗、移栽大田等成為育種研究材料。